Metodi di indagine

Quando i patogeni da ricercare sono funghi o batteri occorre operare su livelli di indagine più approfonditi:

  • la camera umida, un contenitore sterile in vetro o plastica (capsula Petri), nel quale viene creato artificialmente un ambiente saturo di umidità. In essa si pone il campione da analizzare, precedentemente lavato e leggermente disinfettato. In questo modo si favorisce la comparsa e la crescita di eventuali patogeni e il loro riconoscimento.
    Costituisce un primo livello di indagine, semplice e a volte risolutivo nel determinare l'agente che causa la malattia. Non sempre però è facile interpretare i risultati della camera umida, dal momento che non tutti i funghi patogeni sviluppano con questa tecnica e, spesso, questi vengono sopraffatti da organismi estranei.
  • l'isolamento su piastra, una tecnica di laboratorio utilizzata per la ricerca di funghi o di batteri.
    Quando si ricercano funghi, dal campione lavato e disinfettato esternamente, si prelevano pezzetti di tessuto e si pongono sul substrato nutritivo artificiale contenuto in capsule Petri. Tale substrato consente la crescita e la fruttificazione di eventuali patogeni presenti nei tessuti vegetali, che potranno essere identificati mediante l'analisi al microscopio delle caratteristiche degli organi riproduttivi.
    Quando si ricercano batteri, dal campione si prelevano parti di tessuto vegetale che vengono opportunamente macerate, diluite e seminate su capsule Petri contenenti terreni nutritivi. Si procede quindi al riconoscimento mediante test e prove fisiologiche specifiche.

In seguito si possono effettuare esami ancora più mirati come:

  • test IFAS (immunofluorescent Antibody), una tecnica sierologica che costituisce una procedura di indagine sofisticata molto utilizzata per l'identificazione di batteri.
    Le tecniche sierologiche si basano sulla capacità degli anticorpi (prodotti da alcuni mammiferi in risposta alla presenza di un antigene) di riconoscere gli antigeni (le cellule batteriche) anche al di fuori del sistema immunitario in cui si sono formati, consentendo quindi di operare anche in condizioni di laboratorio. La reazione che lega l'anticorpo al suo antigene può essere messa in evidenza attraverso particolari composti fluorescenti. Per poter eseguire questa tecnica è necessario disporre di una idonea attrezzatura e degli anticorpi specifici per ogni tipo di batterio che si vuole identificare. In particolare occorre un microscopio ottico dotato di lampada epifluorescente, particolari vetrini con pozzetti nei quali fare avvenire la reazione anticorpo - antigene, i composti fluorescenti necessari per evidenziare la presenza dei batteri.
  • test PCR (Polymerase Chain Rreaction). La reazione a catena della polimerasi (PCR) consente di copiare e amplificare frammenti di DNA noti.
    Mediante questa tecnica si può quindi rilevare la presenza di determinati patogeni nelle piante copiando e amplificando parte del loro corredo genetico ed evidenziando il DNA copiato mediante una analisi proteica. Per poter effettuare la PCR occorre conoscere almeno parte del corredo genetico del patogeno che si vuole rilevare. Il laboratorio diagnostico attualmente utilizza la PCR prevalentemente per l'individuazione del fitoplasma della flavescenza dorata e di alcuni batteri fitopatogeni. Data la notevole versatilità di questa metodica si prevede di utilizzarla in futuro anche per alcune diagnosi fungine
  • test ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), tecnica sierologica di immuno-assorbimento e marcatura enzimatica è una procedura di indagine sofisticata e molto sensibile utilizzata soprattutto per l'identificazione di virus.
    Le tecniche sierologiche si basano sulla capacità degli anticorpi (prodotti da alcuni mammiferi in risposta alla presenza di un antigene) di riconoscere gli antigeni (le particelle virali), anche al di fuori del sistema immunitario in cui si sono formati. Nel caso del test ELISA la reazione viene amplificata e resa quindi visibile per mezzo di legami enzimatici di tipo colorimetrico. Per poter eseguire questa tecnica è necessario disporre di una idonea attrezzatura e degli antisieri specifici per ogni virus che si vuole identificare.
  • prove fisiologiche che sono utilizzate allo scopo di giungere all'identificazione di batteri sfruttandone la notevole variabilità biochimica a fini diagnostici. Le varie specie batteriche sono infatti in grado di utilizzare solo determinati composti organici, oppure di produrre sostanze di riserva che possono essere evidenziate con colorazioni particolari, oppure ancora di crescere in particolari condizioni di temperatura o in presenza di sostanze tossiche.
    I saggi biochimici sono un valido aiuto per giungere con un buon margine di sicurezza alla determinazione del genere e, in alcuni casi, anche della specie batterica.

 

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